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    看完此文,別再說不懂1/2/3代PCR!

    實驗室資訊網時間:2019-07-11 點擊: 百度搜索 | 必應搜索 | 搜狗搜索

    【導讀】Mullis在發明PCR技術后曾這樣描述:用一個單分子DNA,PCR能在一個下午內產生100百萬個相似的分子。只需要一個管子、一些簡單的試劑和一個用來加熱的設備。 從PCR技術發明至今已過30年,而PCR技術剛好發展到第三代,在過去的30年里PCR技術為生命科學的發展做出了不可磨滅的貢獻。 ◆◆ 一代PCR◆◆ 通常我......
    TAG標簽: PCR 代PCR 2代PCR 3代PCR

    Mullis在發明PCR技術后曾這樣描述:“用一個單分子DNA,PCR能在一個下午內產生100百萬個相似的分子。只需要一個管子、一些簡單的試劑和一個用來加熱的設備”。

    從PCR技術發明至今已過30年,而PCR技術剛好發展到第三代,在過去的30年里PCR技術為生命科學的發展做出了不可磨滅的貢獻。

    ◆◆ 一代PCR◆◆

    通常我們說的第一代PCR技術就是最初的PCR,采用普通PCR擴增儀來對靶基因進行擴增,然后采用瓊脂糖凝膠電泳對產物進行分析,只能做定性分析。

    技術原理圖解



    看完此文,別再說不懂1/2/3代PCR!

    擴增原理

    技術應用

    能將微量的 DNA 大幅增加。因此對化石中的古生物殘骸,犯罪現場的毛發、皮膚碎屑或血液,只要能分離出一丁點的DNA,就能用PCR加以放大,進行比對。

    技術優勢

    PCR 是一種用于放大擴增特定的 DNA 片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊 DNA 復制。

    技術缺點

    1. 最初的PCR技術所采用的核酸染料,會對實驗人員和環境造成傷害

    2. PCR完成之后需要開蓋檢測,容易發生污染造成假陽性結果

    3. 檢測耗時長,操作麻煩,容易出錯

    4. 只能做定性檢測

    ◆◆二代PCR◆◆

    第二代PCR就是熒光定量PCR技術(Real-Time PCR),也叫做qPCR, 熒光定量PCR通過在反應體系中加入能夠指示反映進程的熒光探針,通過熒光信號的積累來監測擴增產物的積累。通過熒光曲線來判斷結果,并可以借助Cq值和標準曲線來定量。

    技術原理圖解



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    技術應用

    用于傳染性疾病病原體檢測,疾病耐藥基因研究,藥物療效考核,遺傳疾病診斷

    技術優點

    1. 污染風險低

    2. 操作流程更簡單、經濟高效

    3. 需要的DNA和RNA加樣量少

    技術缺點

    1. 不同廠家生產的試劑和設備所產生的Cq值之間存在一定的差異,并不具備可比性

    2. 存在背景值的影響,結果易產生偏差

    3. 對于低拷貝的DNA往往難以檢測

    4. 當反應體系中有PCR抑制物存在時,常規的PCR體系經常會受到影響。

    ◆◆三代PCR◆◆

    第三代PCR技術叫做數字PCR(Digital PCR, dPCR, Dig-PCR),這是目前全新的一種PCR檢測方式,能對核酸進行檢測和定量,采用直接計數目標分子而不依賴任何校準物或者外表,即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目。

    技術原理圖解



    看完此文,別再說不懂1/2/3代PCR!

    技術應用

    用于大量正常細胞群中檢測少數含突變的細胞。通過稀釋樣品DNA到對應的檢測孔中,經過PCR擴增之后,向每個孔里加入特異性熒光探針與產物雜交,然后直接計數樣本中突變型和野生型等位子的數量。

    主要應用于突變分析、等位基因缺失、混雜DNA的癌癥檢測等等。

    技術優點

    1.靈敏度更高

    數字PCR將傳統的PCR反應分割成了數萬個體系,這些體系獨立擴增,獨立檢測,保證了個位數的模板數量都可以被檢測到。

    2.定量更準確

    數字PCR通過微體系的熒光計數,直接將反應初始模板數量統計出來,即使某些微滴中的模板數量不止一個,也可以通過泊松分布進行計算。

    3.抗干擾能力更強

    數字PCR第一步反應體系的分配過程中,會將模板和抑制物分配到不同的體系,降低抑制物的干擾。并且,與qPCR不同的是,dPCR檢測的是終點熒光,即使微體系稍微受到了影響,也不會影響最終結果的判讀。

    技術缺點

    1.模板質量要求較高

    由于數字PCR將反應拆分成了數萬個獨立體系,因此其對模板量有比較高的要求,模板量超過微體系量會導致無法定量,過少會導致信號過低,降低定量準確度。

    2.非特異性產物的判斷

    數字PCR觀測的是每個體系中的終點熒光,無論PCR產物是否是特異性產物,只要熒光信號足夠強,也是會判讀為陽性結果。因此dPCR的引物特異性要求極高。

    (本文來源:VD從業者 作者:鎖炎 )

    (責任編輯:子豪)

    引用地址:

    TAG標簽: PCR 代PCR 2代PCR 3代PCR
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