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Mullis在發明PCR技術后曾這樣描述：“用一個單分子DNA，PCR能在一個下午內產生100百萬個相似的分子。只需要一個管子、一些簡單的試劑和一個用來加熱的設備”。 從PCR技術發明至今已過30年，而PCR技術剛好發展到第三代，在過去的30年里PCR技術為生命科學的發展做出了不可磨滅的貢獻。 ◆◆ 一代PCR◆◆ 通常我們說的第一代PCR技術就是最初的PCR，采用普通PCR擴增儀來對靶基因進行擴增，然后采用瓊脂糖凝膠電泳對產物進行分析，只能做定性分析。 技術原理圖解  擴增原理 技術應用 能將微量的 DNA 大幅增加。因此對化石中的古生物殘骸，犯罪現場的毛發、皮膚碎屑或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。 技術優勢 PCR 是一種用于放大擴增特定的 DNA 片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊 DNA 復制。 技術缺點 1. 最初的PCR技術所采用的核酸染料，會對實驗人員和環境造成傷害 2. PCR完成之后需要開蓋檢測，容易發生污染造成假陽性結果 3. 檢測耗時長，操作麻煩，容易出錯 4. 只能做定性檢測 ◆◆二代PCR◆◆ 第二代PCR就是熒光定量PCR技術（Real-Time PCR），也叫做qPCR, 熒光定量PCR通過在反應體系中加入能夠指示反映進程的熒光探針，通過熒光信號的積累來監測擴增產物的積累。通過熒光曲線來判斷結果，并可以借助Cq值和標準曲線來定量。 技術原理圖解  技術應用 用于傳染性疾病病原體檢測，疾病耐藥基因研究，藥物療效考核，遺傳疾病診斷 技術優點 1. 污染風險低 2. 操作流程更簡單、經濟高效 3. 需要的DNA和RNA加樣量少 技術缺點 1. 不同廠家生產的試劑和設備所產生的Cq值之間存在一定的差異，并不具備可比性 2. 存在背景值的影響，結果易產生偏差 3. 對于低拷貝的DNA往往難以檢測 4. 當反應體系中有PCR抑制物存在時，常規的PCR體系經常會受到影響。 ◆◆三代PCR◆◆ 第三代PCR技術叫做數字PCR（Digital PCR, dPCR, Dig-PCR）,這是目前全新的一種PCR檢測方式，能對核酸進行檢測和定量，采用直接計數目標分子而不依賴任何校準物或者外表，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目。 技術原理圖解  技術應用 用于大量正常細胞群中檢測少數含突變的細胞。通過稀釋樣品DNA到對應的檢測孔中，經過PCR擴增之后，向每個孔里加入特異性熒光探針與產物雜交，然后直接計數樣本中突變型和野生型等位子的數量。 主要應用于突變分析、等位基因缺失、混雜DNA的癌癥檢測等等。 技術優點 1.靈敏度更高 數字PCR將傳統的PCR反應分割成了數萬個體系，這些體系獨立擴增，獨立檢測，保證了個位數的模板數量都可以被檢測到。 2.定量更準確 數字PCR通過微體系的熒光計數，直接將反應初始模板數量統計出來，即使某些微滴中的模板數量不止一個，也可以通過泊松分布進行計算。 3.抗干擾能力更強 數字PCR第一步反應體系的分配過程中，會將模板和抑制物分配到不同的體系，降低抑制物的干擾。并且，與qPCR不同的是，dPCR檢測的是終點熒光，即使微體系稍微受到了影響，也不會影響最終結果的判讀。 技術缺點 1.模板質量要求較高 由于數字PCR將反應拆分成了數萬個獨立體系，因此其對模板量有比較高的要求，模板量超過微體系量會導致無法定量，過少會導致信號過低，降低定量準確度。 2.非特異性產物的判斷 數字PCR觀測的是每個體系中的終點熒光，無論PCR產物是否是特異性產物，只要熒光信號足夠強，也是會判讀為陽性結果。因此dPCR的引物特異性要求極高。 （本文來源：VD從業者 作者：鎖炎 ）(責任編輯：子豪) |